国際科学技術庁の南部博士の下に結成された少年科学忍者隊が、世界征服を企み様々な犯罪を行う悪の秘密結社ギャラクター（総裁X、首領ベルク・カッツェ）と戦う。
リーベ フラッ ザイル クチン セドラ タコメ ブラウ レット シスプ じゃくやく ラップワピ デリバリ ツワブキ フリーダム ソート ナビタイア メンマ タルト ガネット スニファー オート スコア えーびー ちょうい たんし ニヒル モップ 国内チュ ティーン ギャレー 幻のユウ ブイゾ シールド パサー タジン ダウンライト コスル ナポリ ヒモパン ジューシー ショー ポニカ いーん リターン パリー トライア バスー 山菜サーチ ヴェリ ローズ
ガッチャマン―大鷲の健/G-1号（声：森功至）
18歳。本名・鷲尾健。科学忍者隊のリーダー。身長180センチ、体重60キロ。普段はテストパイロット。変身後の武器は鳥の形をしたブーメラン。一般的には「バードラン」と言う名前で呼ばれているが、これは武器の名称ではなく、変身時の「バード ゴー！」同様にブーメランを投げる際に言う掛け声である。なお、本編中では本名は必要最小限以外では出てこず、専ら名のみ、若しくは通り名で呼ばれている。普段はあまり金がないらしく、ジュンの経営するスナックでしばしばツケで飲み食いをし、甚平に支払いを求められている。ジュンに恋愛対象としての好意を持たれているのだが、科学忍者隊の任務を最優先する気持ちと、色恋沙汰にまるっきり疎いため、そのことに全く気がついていない。
コンドルのジョー/G-2号（声：佐々木功（現・ささきいさお））
18歳。本名・ジョージ浅倉。日系イタリア人。身長185センチ、体重60キロ。メンバーの中で一番大人びていて、無鉄砲で皮肉屋。健と何かと対立することが多い（特にバードミサイルの発射に関して）が、お互いの力は認め合っている。また、皮肉屋と言っても性格は明るく、人付き合いはよい。ギャラクター隊員（父ジュゼッペ、母カテリーナの浅倉夫妻）の子として生まれるが、逃亡を図った彼らはギャラクターに殺害され、自身も南部に助けられた過去がある。普段はレーサー。変身後の武器は羽根手裏剣と、ワイヤー弾、信号弾など様々な種類の弾を撃つことができる拳銃、エアーガン。なお、本作に於いては羽根手裏剣は他のキャラも使っており（健とジュンがそれぞれ一度ずつ）、必ずしも彼専用の武器というわけではない。アイキャッチの「ガッチャマン！」と言う声はささきが担当しており、次作『II』以降もアイキャッチで使用されている。
白鳥（しらとり）のジュン/G-3号（声：杉山佳寿子）
16歳。アメリカ人と日本人のハーフ。身長160センチ、体重45キロ。普段はゴーゴー喫茶・スナックJを経営している美少女。だが、本人は料理が苦手なので専ら甚平が担当している（目玉焼き程度しかできないらしい）。このスナックJは、ジュンと甚平の家であると同時に、忍者隊メンバーの溜り場兼情報交換の場になっている。孤児院で育った少女のためかどうかは解らないが、苗字は作品中では明らかにされていない。しかし、自分の生い立ちをある程度ジュン本人が覚えている（ハーフであることなど）ので、実際には苗字はあると思われる。変身後の武器は刃が仕込まれたヨーヨー。爆弾のプロでもある。健に人知れず恋愛感情を持っている（甚平にはたびたびそのことでからかわれている）のだが、なかなか健本人にはそれが伝わらず、そのことで悩んでいたりもする。
燕（つばくろ）の甚平/G-4号（声：塩屋翼）
推定年齢11歳。身長120センチ、体重30キロ。孤児で、ジュンと同じ孤児院で育った。そのため、ジュンを姉のように慕う。ジュンと同じく苗字は不明。スナックJのウェイター兼料理人で、普段もジュンと一緒に暮らしている。第一話では伊賀忍者一族の末裔と自称している。変身後の武器はアメリカンクラッカー。打撃を加えたり敵に投げつけて動きを封じたりする。担当声優の塩屋はこの頃はまだ子役声優で、自身もまさに変声期に差し掛かった時期であったため、第1話と最終回では、声色が全く変わっている。誕生日はジュンと出会った日で、「甚平」と言う名前もジュンが付けたという設定。なお「甚平」という名の由来は企画の鳥海尽三いわく「ぼくのおじさんの名前」とのことである。
みみずくの竜/G-5号（声：兼本新吾）
17歳。本名・中西竜。身長170センチ、体重80キロ。日本の東北地方の漁師の息子。普段はヨットハーバーの管理人。のんびりしているが海で鍛えた怪力を持ち、水中戦や船の操船で活躍する。ゴッドフェニックスのメインパイロットも務める。メンバーの中で唯一「明確に」肉親（両親と弟）が存在している（実際には物語の途中までは健の父親も生きていた）ため、南部博士の配慮で戦闘に直接加わることは少なく、G-5号で待機していることが多いため目立たないが（本人も留守番役に文句を言う描写が多い）、ジョーと同様のエアーガンを持たされてはいる。とはいえほとんど使われず、白兵戦時は専ら怪力一本で戦う。
南部考三郎博士（声：大平透）
48歳。科学忍者隊生みの親で、彼らの親代わりでもある。オックスフォード大学とケンブリッジ大学の両方で学んだ天才的な科学者で、科学技術庁長官。のちに国際科学技術庁の最高幹部。その若さで東京大学名誉教授でもある。独身。モデルは芦田伸介。
鷲尾健太郎（レッド・インパルス隊長）（声：吉沢久嘉 ）
南部博士とは長年の親友。サングラスで素性を隠しているが、実は健の父親。
正木（レッド・インパルス隊員 (No.2)）（声：青野武、横井光夫（現・玄田哲章））
104話で狙撃手に眉間を撃ち抜かれ即死。
声優の横井（玄田）は脇役として準レギュラー出演し、レッド・インパルス正木隊員の声だけでなく、1度しか登場しないキャラクターや、ギャラクター隊員など本作品の「その他大勢」の声を1人で何役も担当した。これは声優用語で「ガヤ」と呼ばれ、デビュー2年目か3年目の若手が担当することが多い。
鬼石（レッド・インパルス隊員 (No.3)）（声：横井光夫（現・玄田哲章））
幼少時にギャラクターに舌を抜かれ、それ以後ギャラクターと判明した相手を必ず殺している。
アンダーソン（声：大宮悌二）
国際科学技術庁長官。次作『科学忍者隊ガッチャマンII』では終盤に重傷を負う。サム（声：塩沢兼人）という孫がおり、彼は『ガッチャマンII』終盤に登場した。
ベルク・カッツェ（声：寺島幹夫）
ギャラクターの「首領」で、自称「次期総裁」。総裁Xの忠実な配下として、ギャラクターの実働部隊を指揮する。特技は変身で女性に化けることがほとんど（女性に変装した時の声は主に沢田敏子と此島愛子が担当した）。これはカッツェ女性説の一因である（ほかに口紅を付けていたり、感情の起伏が激しい…などがある）。実態は総裁Xによって男女二人の人間が掛け合わされたミュータントであり（IQが280と相当に高いのも、二人分の脳細胞を持つから、という説明がなされている。ちなみにIQの定義から言うとこの説明はありえない）、彼の正体を探るのも番組の伏線の1つであった。
「デブルスター」と言うUFOのような乗り物に乗り指揮を執る。概して作戦を立てたり、メカを考案したりする「軍師」的存在であり、作戦の実行は「隊長」と呼ばれるギャラクター隊員の比較的優秀な者に担わせている。そのため、実戦力は皆無に近く個人戦ではボロボロにやられている（ただし、第7話で自ら鞭を振るってロケットや飛行機を破壊したり、第35話で乗っ取った国の大臣を宮殿の窓から投げ飛ばすなど、若干の作戦実行経験もある）。そして「お約束」となっている逃げ足の早さはどの悪役にも負けないほどであり、ガッチャマン達もカッツェの逃げ足の早さには舌を巻いている（メカには必ずカッツェ用の脱出ポッドがある）。隊員を見捨てることもしばしばで、隊員を消耗品ぐらいにしか見ていないと思われるのだが、隊長や隊員達からは「カッツェ様」と呼ばれている。
自らの生みの親である総裁Xの評価を異常なまでに気にしており、作戦が失敗したり一言多かったりして総裁Xに叱責されている（たまに褒められて有頂天になっている時もある）のがお馴染み。特に中盤以降になると、ギャラクター隊員達との掛け合いが笑いを取る方向に進むようになり、シリアスな物語中でのコミカルさを演出していた。しかしただの間抜けな悪役ではなく、最後の最後でその総裁Xに見捨てられて自暴自棄の半狂乱になり自害する場面などに、ミュータントにされた者の悲哀が強く打ち出されていた。名前の由来はドイツ語で「山 (Berg)」+「猫 (Katze)」（山猫そのものに相当するドイツ語の単語はWildkatze）。
総裁X（声：田中信夫）
200万光年離れたアンドロメダ星雲の中にあるセレクトロ星からある命令を受けてやって来た正体不明の支配者。本作では最後まで正体は不明であった。
その正体は4年後の次作『ガッチャマンII』にて明らかになる。
企画段階では「総裁Xは実在せず、ベルク・カッツェを操っていた幻だった」という設定案があったが、アニメではわかりにくいということで採用されなかった。このアイデアは後に『タイムパトロール隊オタスケマン』で陽の目を見ることになる。
隊長
鉄獣メカ一体とギャラクター隊員数十人を率いる指揮官。ほとんどが一回きりのゲストキャラであるが、中にはアルケオ隊長のように二話にわたって登場した者もいる。にもかかわらず派手なコスチュームなどからその印象はきわめて強い。一般隊員から登用された者と外部からスカウトされた者とがおり、前者の場合武勲を上げて勲章20個を獲得することで隊長に昇進できる[3]。また、中期以降は長い期間働いたという理由で昇進した者も登場した。部下にチーフと呼ばれる比較的優秀な隊員がおり、指揮の一端を担わせている。